概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè)āＭㄟ^(guò)對(duì)DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測(cè), 實(shí)現(xiàn)基因的相對(duì)定量、定量和定性分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性*的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

使用方法：
一、唾液鏈球菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）

熒光定量PCR服務(wù)：
產(chǎn)品僅供科研使用簡(jiǎn)介：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
MADB106(大鼠癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×24,5-乙撐二硫代-1,3-二硫酚-2-酮(>98.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC)4,5-Ethylenedithio-1,3-dithiol-2-one

Promocell C-22110 Endothelial Cell GrowthMedium KIT, 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基套裝 500ml4,5-甲二硫基-1,3-二硫醇-2-酮(>95.0%(HPLC))質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(HPLC)4,5-Methylenedithio-1,3-dithiol-2-one

人牙齦成纖維細(xì)胞HGF3,3'-Bithienyl(>98.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC)3,3'-Bithiophene

CL Others Human 人 CL-1 / CL / Chymoypsin-like protease 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 2,1,3-苯并噻二唑(>99.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>99.0%(GC)2,1,3-Benzothiadiazole

盤(pán)羊皮膚細(xì)胞;ASHS34,5-去亞異丙基托吡酯質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口4,5-Desisopropylidene Topiramate
家兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;2012083MSC 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，T/G HA-VSMC細(xì)胞 MPC-11細(xì)胞，小鼠漿細(xì)胞瘤波生坦(水合物)質(zhì)量規(guī)格：≥98.5%（HPLC）,BR,一水合物Bosentan hydrate

人胚;MRC-5波生坦水合(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品Bosentan hydrate

HA Others H4N6 甲型 H4N6 (A/Swine/Oario/01911-1/99) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 福沙吡坦二甲葡胺(MK-0517) 質(zhì)量規(guī)格：>99.0%;P/神經(jīng)激肽受體拮抗劑Fosaprepitant dimeglumine

CL-0404NCI-H596(人肺腺鱗癌細(xì)胞)5×106cells/瓶×2β-硫丹(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品β-Endosulfan

TGM2 Others Human 人 TGM2 / ansglutaminase 2 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 硫丹醇(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品Endosulfan alcohol
CN5 Others Human 人 CN5 / Coactin-5 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) L-ASPARTICACIDL-天門(mén)冬酸*白色粉末RTsigma

大耳山羊皮膚細(xì)胞;LDG-31-錄代二十碳烷 1-CHLOROqICOScNq 417-0-7

IL5RA Others Mouse 小鼠 IL5Ra / CD125 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) BROMOpxenOLBLUEwo7iumSALT溴酚藍(lán),鈉鹽ACS級(jí)淺紅色至紫色粉末RTsigma

前脂肪細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)199培養(yǎng)基1盒

興國(guó)鯉尾鰭細(xì)胞;XGL 人細(xì)胞，SW480[SW-480]細(xì)胞 Tca-8113(舌鱗癌細(xì)胞)Urea 250g/500g/1kg/5kg原裝 Amresco 0378
唾液鏈球菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒MA, 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽L-Glutamic acid diethyl ester hydrochloride質(zhì)量規(guī)格：0.97

RDFs, 大鼠真皮成纖維細(xì)胞 ICPB 7[C-1;ICMP 8639;NCPPB 2626]細(xì)胞 CGM1(EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞)L-絲氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)L-Serine質(zhì)量規(guī)格：>99%,標(biāo)準(zhǔn)品

人口腔表皮樣癌細(xì)胞;KBL-精氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品）L-Arginine質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

SERPINF1 Others Human 人 SerpinF1 / SERPINF1 / PEDF 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) L-精氨酸L-Arginine質(zhì)量規(guī)格：≥98%,BR

人APP基因轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株;7WD10L-精氨酸鹽酸鹽L-Arginine hydrochloride質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。